Значение нервной ткани в организме определяется основными свойствами нервных клеток (нейронов, нейроцитов) воспринимать раздражение, приходить в состояние возбуждения, вырабатывать импульс и передавать его.
Нервная ткань состоит из нейронов (neuronum ), выполняющих специфическую функцию, и нейроглии (neuroglia ), обеспечивающей существование нервных клеток и осуществляющей опорную, трофическую, разграничительную, секреторную и защитную функции.
Признание нейрона основным элементом нервной ткани – главное достижение нейроанатомов начала XX в. Физиологи определили, какими электрическими и химическими способами нейрон передает свои сигналы. Эти два достижения не раскрывают, каким образом работает мозг, но они служат необходимым фундаментом для этого.
Прогресс в детальном изучении строения мозга связан с успехами ранних исследований по микроструктуре, проводившихся, например, английским анатомом Аугустом фон Валлером. Онразработал химический метод, позволивший выделять пучки отмирающих нервных волокон (так называемая валлеровская дегенерация). Окрашивание по этому методу помогло установить, что длинные волокна, образующие периферические нервы, – это отростки клеток, находящихся внутри головного и спинного мозга. Некоторые крупные из них можно было даже увидеть с помощью примитивных микроскопов. Хотя микроскопы были и раньше, очень сложные и компактные клеточные структуры мозга с трудом поддавались исследованию. Понадобились новые красители, чтобы отдельные клетки стали хорошо видимыми.
Итальянский анатом К. Гольджи примерно в 1875 г. изобрел метод, при котором одновремен-но окрашивается, по-видимому в случайном порядке, лишь очень малая доля всех клеток данного участка, но зато они окрашиваются целиком. При хорошо выполненном окрашивании по Гольджи на препарате видны лишь несколько нейронов, но каждый из них полностью, со всеми своими ветвями. Просмотрев много срезов мозга, окрашенных по Гольджи, анатом может дать перечень разных клеток в этой ткани. До сих пор неизвестно, как и почему срабатывает метод Гольджи, окрашивая полностью одну из 100 клеток и совершенно не затрагивая все остальные.
Современник К. Гольджи – испанец С. Рамон-и-Кахал посвятил всю свою плодотворную жизнь приложению нового метода практически ко всем частям нервной системы. Его гигантская «Histologic du systеme nerveux de l’homme et des vertebres» («Гистология нервной системы человека и позвоночных животных»), впервые опубликованная в 1904 г. на испанском языке, до сих пор остается самой фундаментальной монографией по нейробиологии. Во времена Рамон-и-Кахала шел спор о степени непрерывности между клетками. Отделены ли клетки одна от другой полностью, или же они соединены от аксона к дендриту в непрерывную сеть? Если бы существовала непрерывность протоплазмы, то сигналы, генерируемые одной клеткой, могли бы переходить в соседнюю, не прерываясь; если же непрерывности нет, то тогда должен существовать специальный процесс генерации сигналов заново в каждой клетке.
На препаратах Кахала, окрашенных по Гольджи, выявляется множество обособленных, полностью окрашенных клеток, и никогда не было видно ничего похожего на сеть. Таким образом, его первым большим достижением явилось представление о нервной системе как о совокупности отдельных, обособленных клеток, которые сообщаются друг с другом с помощью синапсов.
Кахал внес второй вклад в науку, пожалуй, еще более значительный: собрал множество данных о том, что сложные связи между нейронами не случайны, а высоко структурированы и специфичны. Он дал исчерпывающее описание архитектоники десятков различных структур мозга и в каждом случае идентифицировал и классифицировал разные клетки, а иногда показывал, насколько позволяли его методы, как эти клетки связаны между собой. Стало ясно, что если нейробиолог хочет понять мозг, он должен не только изучить, как построены разные его части, но и раскрыть их назначение и детально исследовать их работу как отдельных структур и в совокупности. Но сначала нужно узнать, как отдельный нейрон генерирует сигналы и передает их следующей клетке.
Долгое время нейроанатомам приходилось довольствоваться подробными описаниями, основанными на световой микроскопии с окрашиванием по Гольджи и по Нисслю (Nissl) (последнее выделяет тела отдельных клеток без дендритов и аксонов). Первым действенным орудием прослеживания связей между разными мозговыми структурами, например между разными областями коры большого мозга или между корой и стволом мозга и мозжечком, явился метод окрашивания, который предложил в начале 50-х годов XX в. в Голландии У. Наута (W. Nauta). Он основан на том, что при разрушении нейрона (механическим, электрическим или тепловым воздействием) отходящее от него нервное волокно дегенерирует и, пока оно еще не совсем исчезло, окрашивается иначе, чем соседние нормальные волокна. Если разрушить определенную часть мозга и через несколько дней окрасить мозг методом Науты, а затем исследовать под микроскопом, то наличие избирательно окрашенных волокон в какой-либо другой и, возможно, даже отдаленной его части будет означать, что эта часть получает волокна от разрушенного участка. Такой метод привел к необычайному расширению и детализации карты мозга.
За последнее десятилетие благодаря новейшим эффективным методам нейроанатомия продвинулась вперед больше, чем за предыдущие 50 лет. Успехи достигнуты отчасти благодаря усовершенствованным химическим методикам и лучшему пониманию того, как различные вещества воспринимаются нейронами и передаются в обоих направлениях вдоль нервных волокон. Типичным примером может служить радиоавтография. Радиоактивное вещество вводится в ту или иную структуру мозга, тела клеток поглощают его, пересылают по своим аксонам, и оно накапливается в их окончаниях. Если затем приготовить срез ткани мозга, наложить его на фотоэмульсию и исследовать под микроскопом расположение проявленных зерен серебра, удается выявить «места назначения» аксонов. Можно вводить другие вещества, которые, наоборот, воспринимаются нервными окончаниями и передаются по аксонам в обратном направлении – к телу клетки, выявляя место возникновения аксона.
Важным достижением явилась методика, разработанная Л. Соколовым в Национальном институте охраны психического здоровья в США. Глюкоза служит «топливом» для нейронов, и в активном состоянии клетки потребляют больше глюкозы, чем в покое. Меченая дезоксиглюкоза усваивается клетками, как если бы это была глюкоза. Она расщепляется, как глюкоза, но продукт первого этапа ее метаболизма не подвергается дальнейшим превращениям. Не имея возможности выйти из клетки, этот продукт скапливается в ней, и степень радиоактивности в определенных клетках указывает на их функциональную активность. Можно поставить, например, такой опыт: ввести это вещество внутривенно лабораторному животному, а затем предъявить звуковой раздражитель; микроскопическое исследование мозга позволит выявить те его области, которые связаны со слухом. Достаточно недавно разработана новая методика – позитронно-эмиссионная томография, которая позволяет обнаруживать с помощью наружных датчиков присутствие дезоксиглюкозы или других веществ, меченных радиоактивными изотопами, испускающими позитроны. Эта перспективная методика делает возможным картирование активных структур мозга in vivo у лабораторного животного или у человека.
Применение всех существующих методик для выявления в первом приближении, без деталей, связей в одной только структуре (скажем, в части коры больших полушарий или в мозжечке) может занять у одного-двух анатомов пять или десять лет. А поскольку мозг состоит из сотен разных структур, становится ясно, что одного только понимания связей в головном мозгу придется ждать еще много лет.
Содержание статьи
ГИСТОЛОГИЯ, наука, занимающаяся изучением тканей животных. Тканью называют группу клеток, сходных по форме, размерам и функциям и по продуктам своей жизнедеятельности. У всех растений и животных, за исключением самых примитивных, тело состоит из тканей, причем у высших растений и у высокоорганизованных животных ткани отличаются большим разнообразием структуры и сложностью своих продуктов; сочетаясь друг с другом, разные ткани образуют отдельные органы тела.
Гистология изучает ткани животных; исследование растительных тканей обычно относят к анатомии растений. Гистологию иногда называют микроскопической анатомией, поскольку она изучает строение (морфологию) организма на микроскопическом уровне (объектом гистологического исследования служат очень тонкие тканевые срезы и отдельные клетки). Хотя эта наука прежде всего описательная, в ее задачу также входит интерпретация тех изменений, которые происходят в тканях в норме и патологии. Поэтому гистологу необходимо хорошо разбираться в том, как формируются ткани в процессе эмбрионального развития, какова их способность к росту в постэмбриональный период и каким они подвергаются изменениям в различных естественных и экспериментальных условиях, в том числе в ходе своего старения и гибели составляющих их клеток.
История гистологии как отдельной ветви биологии тесно связана с созданием микроскопа и его совершенствованием. М.Мальпиги (1628–1694) называют «отцом микроскопической анатомии», а следовательно гистологии. Гистология обогащалась наблюдениями и методами исследования, проводившимися или создававшимися многими учеными, основные интересы которых лежали в области зоологии или медицины. Об этом свидетельствует гистологическая терминология, увековечившая их имена в названиях впервые описанных ими структур или созданных методов: островки Лангерганса, либеркюновы железы, купферовы клетки, мальпигиев слой, окраска по Максимову, окраска по Гимза и т.п.
В настоящее время получили распространение методы изготовления препаратов и их микроскопического исследования, дающие возможность изучать отдельные клетки. К таким методам относятся техника замороженных срезов, фазово-контрастная микроскопия, гистохимический анализ, культивирование тканей, электронная микроскопия; последняя позволяет детально изучать клеточные структуры (клеточные мембраны, митохондрии и др.). С помощью сканирующего электронного микроскопа удалось выявить интереснейшую трехмерную конфигурацию свободных поверхностей клеток и тканей, которую невозможно увидеть под обычным микроскопом.
Происхождение тканей.
Развитие зародыша из оплодотворенного яйца происходит у высших животных в результате многократных клеточных делений (дробления); образующиеся при этом клетки постепенно распределяются по своим местам в разных частях будущего зародыша. Первоначально эмбриональные клетки похожи друг на друга, но по мере нарастания их количества они начинают изменяться, приобретая характерные особенности и способность к выполнению тех или иных специфических функций. Этот процесс, называемый дифференцировкой, в конечном итоге приводит к формированию различных тканей. Все ткани любого животного происходят из трех исходных зародышевых листков: 1) наружного слоя, или эктодермы; 2) самого внутреннего слоя, или энтодермы; и 3) среднего слоя, или мезодермы. Так, например, мышцы и кровь – это производные мезодермы, выстилка кишечного тракта развивается из энтодермы, а эктодерма образует покровные ткани и нервную
систему.
Основные типы тканей.
Гистологи обычно различают у человека и высших животных четыре основных ткани: эпителиальную, мышечную, соединительную (включая кровь) и нервную. В одних тканях клетки имеют примерно одинаковую форму и размеры и так плотно прилегают одна к другой, что между ними не остается или почти на остается межклеточного пространства; такие ткани покрывают наружную поверхность тела и выстилают его внутренние полости. В других тканях (костной, хрящевой) клетки расположены не так плотно и окружены межклеточным веществом (матриксом), которое они продуцируют. От клеток нервной ткани (нейронов), образующих головной и спинной мозг, отходят длинные отростки, заканчивающиеся очень далеко от тела клетки, например в местах контакта с мышечными клетками. Таким образом, каждую ткань можно отличить от других по характеру расположения клеток. Некоторым тканям присуще синцитиальное строение, при котором цитоплазматические отростки одной клетки переходят в аналогичные отростки соседних клеток; такое строение наблюдается в зародышевой мезенхиме, рыхлой соединительной ткани, ретикулярной ткани, а также может возникнуть при некоторых заболеваниях.
Многие органы состоят из тканей нескольких типов, которые можно распознать по характерному микроскопическому строению. Ниже дается описание основных типов тканей, встречающихся у всех позвоночных животных. У беспозвоночных, за исключением губок и кишечнополостных, тоже имеются специализированные ткани, аналогичные эпителиальной, мышечной, соединительной и нервной тканям позвоночных.
Эпителиальная ткань.
Эпителий может состоять из очень плоских (чешуйчатых), кубических или же цилиндрических клеток. Иногда он бывает многослойным, т.е. состоящим из нескольких слоев клеток; такой эпителий образует, например, наружный слой кожи у человека. В других частях тела, например в желудочно-кишечном тракте, эпителий однослойный, т.е. все его клетки связаны с подлежащей базальной мембраной. В некоторых случаях однослойный эпителий может казаться многослойным: если длинные оси его клеток расположены непараллельно друг другу, то создается впечатление, что клетки находятся на разных уровнях, хотя на самом деле они лежат на одной и той же базальной мембране. Такой эпителий называют многорядным. Свободный край эпителиальных клеток бывает покрыт ресничками, т.е. тонкими волосовидными выростами протоплазмы (такой ресничный эпителий выстилает, например, трахею), или же заканчивается «щеточной каемкой» (эпителий, выстилающий тонкий кишечник); эта каемка состоит из ультрамикроскопических пальцевидных выростов (т.н. микроворсинок) на поверхности клетки. Помимо защитных функций эпителий служит живой мембраной, через которую происходит всасывание клетками газов и растворенных веществ и их выделение наружу. Кроме того, эпителий образует специализированные структуры, например железы, вырабатывающие необходимые организму вещества. Иногда секреторные клетки рассеяны среди других эпителиальных клеток; примером могут служить бокаловидные клетки, вырабатывающие слизь, в поверхностном слое кожи у рыб или в выстилке кишечника у млекопитающих.
Мышечная ткань.
Мышечная ткань отличается от остальных своей способностью к сокращению. Это свойство обусловлено внутренней организацией мышечных клеток, содержащих большое количество субмикроскопических сократительных структур. Существует три типа мышц: скелетные, называемые также поперечнополосатыми или произвольными; гладкие, или непроизвольные; сердечная мышца, являющаяся поперечнополосатой, но непроизвольной. Гладкая мышечная ткань состоит из веретеновидных одноядерных клеток. Поперечнополосатые мышцы образованы из многоядерных вытянутых сократительных единиц с характерной поперечной исчерченностью, т.е. чередованием светлых и темных полос, перпендикулярных длинной оси. Сердечная мышца состоит из одноядерных клеток, соединенных конец в конец, и имеет поперечную исчерченность; при этом сократительные структуры соседних клеток соединены многочисленными анастомозами, образуя непрерывную сеть.
Соединительная ткань.
Существуют различные типы соединительной ткани. Самые важные опорные структуры позвоночных состоят из соединительной ткани двух типов – костной и хрящевой. Хрящевые клетки (хондроциты) выделяют вокруг себя плотное упругое основное вещество (матрикс). Костные клетки (остеокласты) окружены основным веществом, содержащим отложения солей, главным образом фосфата кальция. Консистенция каждой из этих тканей определяется обычно характером основного вещества. По мере старения организма содержание минеральных отложений в основном веществе кости возрастает, и она становится более ломкой. У маленьких детей основное вещество кости, а также хряща богато органическими веществами; благодаря этому у них обычно бывают не настоящие переломы костей, а т.н. надломы (переломы по типу «зеленой ветки»). Сухожилия состоят из волокнистой соединительной ткани; ее волокна образованы из коллагена – белка, секретируемого фиброцитами (сухожильными клетками). Жировая ткань бывает расположена в разных частях тела; это своеобразный тип соединительной ткани, состоящий из клеток, в центре которых находится большая глобула жира.
Кровь.
Кровь представляет собой совершенно особый тип соединительной ткани; некоторые гистологи даже выделяют ее в самостоятельный тип. Кровь позвоночных состоит из жидкой плазмы и форменных элементов: красных кровяных клеток, или эритроцитов, содержащих гемоглобин; разнообразных белых клеток, или лейкоцитов (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов), и кровяных пластинок, или тромбоцитов. У млекопитающих зрелые эритроциты, поступающие в кровяное русло, не содержат ядер; у всех других позвоночных (рыб, земноводных, пресмыкающихся и птиц) зрелые функционирующие эритроциты содержат ядро. Лейкоциты делят на две группы – зернистых (гранулоциты) и незернистых (агранулоциты) – в зависимости от наличия или отсутствия в их цитоплазме гранул; кроме того, их нетрудно дифференцировать, используя окрашивание специальной смесью красителей: гранулы эозинофилов приобретают при таком окрашивании ярко-розовый цвет, цитоплазма моноцитов и лимфоцитов – голубоватый оттенок, гранулы базофилов – пурпурный оттенок, гранулы нейтрофилов – слабый лиловый оттенок. В кровяном русле клетки окружены прозрачной жидкостью (плазмой), в которой растворены различные вещества. Кровь доставляет кислород в ткани, удаляет из них диоксид углерода и продукты метаболизма, переносит питательные вещества и продукты секреции, например гормоны, из одних частей организма в другие. 
Нервная ткань.
Нервная ткань состоит из высоко специализированных клеток – нейронов, сконцентрированных главным образом в сером веществе головного и спинного мозга. Длинный отросток нейрона (аксон) тянется на большие расстояния от того места, где находится тело нервной клетки, содержащее ядро. Аксоны многих нейронов образуют пучки, которые мы называем нервами. От нейронов отходят также дендриты – более короткие отростки, обычно многочисленные и ветвистые. Многие аксоны покрыты специальной миелиновой оболочкой, которая состоит из шванновских клеток, содержащих жироподобный материал. Соседние шванновские клетки разделены небольшими промежутками, называемыми перехватами Ранвье; они образуют характерные углубления на аксоне. Нервная ткань окружена опорной тканью особого типа, известной под названием нейроглии.
Замещение ткани и регенерация.
На протяжении всей жизни организма постоянно происходит изнашивание или разрушение отдельных клеток, что составляет один из аспектов нормальных физиологических процессов. Кроме того, иногда, например в результате какой-то травмы, происходит утрата той или иной части тела, состоящей из разных тканей. В таких случаях для организма крайне важно воспроизвести утраченную часть. Однако регенерация возможна только в определенных границах. Некоторые относительно просто организованные животные, например планарии (плоские черви), дождевые черви, ракообразные (крабы, омары), морские звезды и голотурии, могут восстанавливать части тела, утраченные целиком по каким-либо причинам, в том числе в результате самопроизвольного отбрасывания (аутотомии). Чтобы произошла регенерация, недостаточно одного лишь образования новых клеток (пролиферации) в сохранившихся тканях; новообразованные клетки должны быть способны к дифференцировке, чтобы обеспечить замену клеток всех типов, входивших в утраченные структуры. У других животных, особенно у позвоночных, регенерация возможна лишь в некоторых случаях. Тритоны (хвостатые амфибии) способны регенерировать хвост и конечности. Млекопитающие лишены этой способности; однако и у них после частичного экспериментального удаления печени можно наблюдать в определенных условиях восстановление довольно значительного участка печеночной ткани.
Более глубокое понимание механизмов регенерации и дифференцировки несомненно откроет много новых возможностей для использования этих процессов в лечебных целях. Фундаментальные исследования уже внесли большой вклад в развитие методов пересадки кожи и роговицы. В большинстве дифференцированных тканей сохраняются клетки, способные к пролиферации и дифференцировке, но существуют ткани (в частности, центральная нервная система у человека), которые, будучи полностью сформированными, не способны к регенерации. Примерно в годовалом возрасте центральная нервная система человека содержит положенное ей число нервных клеток, и хотя нервные волокна, т.е. цитоплазматические отростки нервных клеток, способны регенерировать, случаи восстановления клеток головного или спинного мозга, разрушенных в результате травмы или дегенеративного заболевания, неизвестны.
Классическими примерами замещения нормальных клеток и тканей в организме человека служит обновление крови и верхнего слоя кожи. Наружный слой кожи – эпидермис – лежит на плотном соединительнотканном слое, т.н. дерме, снабженной мельчайшими кровеносными сосудами, доставляющими ей питательные вещества. Эпидермис состоит из многослойного плоского эпителия. Клетки его верхних слоев постепенно трансформируются, превращаясь в тонкие прозрачные чешуйки – процесс, называемый ороговением; в конце концов эти чешуйки слущиваются. Такое слущивание особенно заметно после сильных солнечных ожогов кожи. У земноводных и пресмыкающихся сбрасывание ороговевшего слоя кожи (линька) происходит регулярно. Ежедневная утрата поверхностных клеток кожи компенсируется за счет новых клеток, поступающих из активно растущего нижнего слоя эпидермиса. Различают четыре слоя эпидермиса: наружный роговой слой, под ним – блестящий слой (в котором начинается ороговение, и его клетки при этом становятся прозрачными), ниже – зернистый слой (в его клетках накапливаются пигментные гранулы, что вызывает потемнение кожи, особенно под действием солнечных лучей) и, наконец, самый глубокий – зачатковый, или базальный, слой (в нем на протяжении всей жизни организма происходят митотические деления, дающие новые клетки для замены слущивающихся).
Клетки крови человека и других позвоночных тоже постоянно обновляются. Каждому типу клеток свойственна более или менее определенная продолжительность жизни, по истечении которой они разрушаются и удаляются из крови другими клетками – фагоцитами («пожирателями клеток»), специально приспособленными для этой цели. Новые кровяные клетки (взамен разрушившихся) образуются в кроветворных органах (у человека и млекопитающих – в костном мозге). Если потеря крови (кровотечение) или разрушение клеток крови под действием химических веществ (гемолитических агентов) наносят клеточным популяциям крови большой ущерб, кроветворные органы начинают продуцировать больше клеток. При потере большого количества эритроцитов, снабжающих ткани кислородом, клеткам тела угрожает кислородное голодание, особенно опасное для нервной ткани. При недостатке лейкоцитов организм теряет способность сопротивляться инфекциям, а также удалять из крови разрушившиеся клетки, что само по себе ведет к дальнейшим осложнениям. В нормальных условиях потеря крови служит достаточным стимулом для мобилизации регенеративных функций кроветворных органов.
Реакции тканей на аномальные условия.
При повреждении тканей возможна некоторая утрата типичной для них структуры в качестве реакции на возникшее нарушение.
Механическое повреждение.
При механическом повреждении (разрезе или переломе) тканевая реакция направлена на то, чтобы заполнить образовавшийся разрыв и воссоединить края раны. К месту разрыва устремляются слабо дифференцированные элементы тканей, в частности фибробласты. Иногда рана бывает так велика, что хирургу приходится вносить в нее кусочки ткани, чтобы стимулировать начальные стадии процесса заживления; для этого используют обломки или даже целые куски кости, полученные при ампутации и хранящиеся в «банке костей». В тех случаях, когда кожа, окружающая большую рану (например, при ожогах), не может обеспечить заживление, прибегают к пересадкам лоскутов здоровой кожи, взятых с других частей тела. Такие трансплантаты в некоторых случаях не приживляются, поскольку пересаженной ткани не всегда удается образовать контакт с теми частями тела, на которые ее переносят, и она отмирает или отторгается реципиентом.
Инородные объекты.
Давление.
Омозолелости возникают при постоянном механическом повреждении кожи в результате оказываемого на нее давления. Они проявляются в виде хорошо знакомых всем мозолей и утолщений кожи на подошвах ног, ладонях рук и на других участках тела, испытывающих постоянное давление. Удаление этих утолщений путем иссечения не помогает. До тех пор, пока давление будет продолжаться, образование омозолелостей не прекратится, а срезая их мы лишь обнажаем чувствительные нижележащие слои, что может привести к образованию ранок и развитию инфекции.
Методы изучения тканей.
Разработано множество специальных методов изготовления тканевых препаратов для микроскопического исследования. Существует также особый метод, называемый культурой тканей, позволяющий наблюдать и исследовать живые ткани.
Культура ткани.
Изолированные кусочки тканей или органов помещают в питательные растворы в условиях, исключающих возможность заражения микробами. В этой необычной среде ткани продолжают расти, проявляя многие особенности (такие, как потребность в питательных веществах, кислороде, определенном пространстве и т.п.), характерные для них в нормальных условиях, т.е. когда они находятся в живом организме. Культивируемые ткани могут сохранять и многие из своих структурных и функциональных признаков: фрагменты сердечной мышцы продолжают ритмически сокращаться, кожа зародыша продолжает расти и дифференцируется в обычном направлении. Однако иногда культивирование выявляет такие свойства ткани, которые у нее в обычных условиях не выражены и могли бы остаться неизвестными. Так, изучая строение клеток аномальных новообразований (опухолей), не всегда удается установить их принадлежность к той или иной ткани или их эмбриональное происхождение. Однако при выращивании в искусственной питательной среде они приобретают черты, характерные для клеток определенной ткани или органа. Это может оказаться чрезвычайно полезным не только для правильной идентификации опухоли, но и для установления органа, в котором она первоначально возникла. Некоторые клетки, например фибробласты (клетки соединительной ткани), очень легко поддаются культивированию, что делает их ценными экспериментальными объектами, в частности в тех случаях, когда необходим однородный материал для испытания новых лекарственных препаратов.
Выращивание тканевой культуры требует определенных навыков и оборудования, однако это важнейший метод изучения живых тканей. Кроме того, он позволяет получить дополнительные данные о состоянии тканей, изучавшихся обычными гистологическими методами.
Микроскопические исследования и гистологические методы.
Даже самый поверхностный осмотр позволяет отличить одни ткани от других. Мышечную, костную, хрящевую и нервную ткани, а также кровь можно распознать невооруженным глазом. Однако для детального исследования необходимо изучать ткани под микроскопом при большом увеличении, позволяющем увидеть отдельные клетки и характер их распределения. Под микроскопом можно исследовать влажные препараты. Пример такого препарата – мазок крови; для его изготовления наносят каплю крови на предметное стекло и размазывают по нему в виде тонкой пленки. Однако эти методы обычно не позволяют получить полную картину распределения клеток, а также участков, в которых ткани соединяются.
Живые ткани, извлеченные из тела, подвергаются быстрым изменениям; между тем любое самое незначительное изменение ткани ведет к искажению картины на гистологическом препарате. Поэтому очень важно сразу же после извлечения ткани из организма обеспечить ее сохранность. Это достигается с помощью фиксаторов – жидкостей различного химического состава, которые очень быстро убивают клетки, не искажая детали их строения и обеспечивая сохранение ткани в этом – фиксированном – состоянии. Состав каждого из многочисленных фиксаторов был разработан в результате многократного экспериментирования, и тем же способом многократных проб и ошибок было установлено нужное соотношение в них разных компонентов.
После фиксации ткань обычно подвергают обезвоживанию. Поскольку быстрый перенос в спирт высокой концентрации привел бы к сморщиванию и деформации клеток, обезвоживание производят постепенно: ткань проводят через ряд сосудов, содержащих спирт в последовательно возрастающей концентрации, вплоть до 100%. После этого ткань обычно переносят в жидкость, хорошо смешивающуюся с жидким парафином; чаще всего для этого используют ксилол или толуол. После кратковременного выдерживания в ксилоле ткань способна поглощать парафин. Пропитывание ведется в термостате, чтобы парафин оставался жидким. Всю эту т.н. проводку производят вручную или же помещают образец в специальный прибор, который проделывает все операции автоматически. Используется и более быстрая проводка с использованием растворителей (например, тетрагидрофурана), способных смешиваться как с водой, так и с парафином.
После того как кусочек ткани полностью пропитался парафином, его помещают в небольшую бумажную или металлическую форму и добавляют в нее жидкий парафин, заливая им весь образец. Когда парафин затвердеет, получается твердый блок с заключенной в нем тканью. Теперь ткань можно нарезать. Обычно для этого используют специальный прибор – микротом. Образцы тканей, взятые во время операции, можно нарезать, предварительно заморозив, т.е. не проводя обезвоживания и заливки в парафин.
Описанную выше процедуру приходится несколько модифицировать, если ткань, например кость, содержит твердые включения. Минеральные компоненты кости необходимо предварительно удалить; для этого ткань после фиксации обрабатывают слабыми кислотами – этот процесс называют декальцинированием. Наличие в блоке кости, не подвергшейся декальцинированию, деформирует всю ткань и повреждает режущий край ножа микротома. Можно, однако, распилив кость на мелкие кусочки и обтачивая их каким-либо абразивом, получить шлифы – чрезвычайно тонкие срезы кости, пригодные для изучения под микроскопом.
Микротом состоит из нескольких частей; главные из них – нож и держатель. Парафиновый блок прикрепляют к держателю, который перемещается относительно края ножа в горизонтальной плоскости, а сам нож при этом остается неподвижным. После того как получен один срез, держатель при помощи микрометрических винтов продвигают вперед на определенное расстояние, соответствующее желаемой толщине среза. Толщина срезов может достигать 20 мкм (0,02 мм) или составлять всего 1–2 мкм (0,001–0,002 мм); она зависит от размеров клеток в данной ткани и обычно колеблется от 7 до 10 мкм. Срезы парафиновых блоков с заключенной в них тканью помещают на предметное стекло. Далее удаляют парафин, помещая стекла со срезами в ксилол. Если нужно сохранить в срезах жировые компоненты, то для заливки ткани вместо парафина используют карбовакс – синтетический полимер, растворимый в воде.
После всех этих процедур препарат готов для окрашивания – очень важного этапа изготовления гистологических препаратов. В зависимости от типа ткани и характера исследования применяют разные методы окрашивания. Эти методы, как и методы заливки ткани, вырабатывались в ходе многолетнних экспериментов; однако постоянно создаются и новые методы, что связано как с развитием новых направлений исследований, так и с появлением новых химических веществ и красителей. Красители служат важным инструментом гистологического исследования в силу того, что они по-разному поглощаются разными тканями или их отдельными компонентами (клеточными ядрами, цитоплазмой, мембранными структурами). В основе окрашивания лежит химическое сродство между сложными веществами, входящими в состав красителей, и определенными компонентами клеток и тканей. Красители применяют в виде водных или спиртовых растворов, в зависимости от их растворимости и выбранного метода. После окрашивания препараты промывают в воде или спирте, чтобы удалить избыток красителя; после этого окрашенными остаются только те структуры, которые поглощают данный краситель.
Чтобы препарат сохранялся в течение достаточно долгого времени, окрашенный срез накрывают покровным стеклом, смазанным каким-нибудь клейким веществом, которое постепенно затвердевает. Для этого используют канадский бальзам (природная смола) и различные синтетические среды. Приготовленные таким образом препараты можно хранить годами. Для изучения тканей в электронном микроскопе, позволяющем выявить ультраструктуру клеток и их компонентов, применяют другие методы фиксации (обычно с использованием осмиевой кислоты и глутаральдегида) и другие среды для заливки (обычно эпоксидные смолы). Специальный ультрамикротом со стеклянным или алмазным ножом позволяет получать срезы толщиной менее 1 мкм, а постоянные препараты монтируют не на предметных стеклах, а на медных сеточках. Недавно были созданы методы, позволяющие применять ряд обычных гистологических процедур окрашивания после того, как ткань была подвергнута фиксации и заливке для электронной микроскопии.
Для описанного здесь трудоемкого процесса необходим квалифицированный персонал, однако при массовом производстве микроскопических препаратов используют конвейерную технологию, при которой многие этапы обезвоживания, заливки и даже окрашивания производятся автоматическими приборами для проводки тканей. В тех случаях, когда необходимо срочно поставить диагноз, в частности во время хирургической операции, ткани, полученные при биопсии, быстро фиксируют и замораживают. Срезы таких тканей изготавливают за несколько минут, не заливают и сразу окрашивают. Опытный патоморфолог может по общему характеру распределения клеток сразу поставить диагноз. Однако для детального исследования такие срезы непригодны.
Гистохимия.
Некоторые методы окрашивания позволяют выявлять в клетках те или иные химические вещества. Возможно дифференциальное окрашивание жиров, гликогена, нуклеиновых кислот, нуклеопротеинов, определенных ферментов и других химических компонентов клетки. Известны красители, интенсивно окрашивающие ткани с высокой метаболической активностью. Вклад гистохимии в изучение химического состава тканей постоянно возрастает. Подобраны красители, флуорохромы и ферменты, которые можно присоединить к специфическим иммуноглобулинам (антителам) и, наблюдая связывание этого комплекса в клетке, идентифицировать клеточные структуры. Эта область исследований составляет предмет иммуногистохимии. Использование иммунологических маркеров в световой и электронной микроскопии способствует быстрому расширению наших знаний о биологии клетки, а также повышению точности медицинских диагнозов.
«Оптическое окрашивание».
Традиционные гистологические методы окрашивания сопряжены с фиксацией, которая убивает ткани. Методы оптического окрашивания основаны на том, что клетки и ткани, различающиеся по толщине и химическому составу, обладают и разными оптическими свойствами. В результате, используя поляризованный свет, дисперсию, интерференцию или фазовый контраст, удается получать изображения, на которых отдельные детали строения хорошо видны благодаря различиям в яркости и (или) окраске, тогда как в обычном световом микроскопе такие детали малоразличимы. Эти методы позволяют изучать как живые, так и фиксированные ткани и исключают появление артефактов, возможных при использовании обычных гистологических методов.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Введение
Организм животных и человека состоит из тканей. Ткань -- это исторически сложившаяся система клеток и неклеточных структур (межклеточное вещество), обладающих общностью строения и специализированных на выполнение определенных функций.
По строению, функции и развитию выделяются следующие виды тканей:
эпителиальная ткань (эпителий);
кровь и лимфа;
соединительная ткань;
мышечная ткань;
нервная ткань.
В состав каждого органа входят различные ткани, тесно связанные между собой. В течение всей жизни организма происходят изнашивание и отмирание клеточных и неклеточных элементов (физиологическая дегенерация) и их восстановление (физиологическая регенерация). Эти процессы в различных тканях протекают по-разному. В процессе жизни во всех тканях происходят медленно текущие возрастные изменения. В настоящее время установлено, что ткани восстанавливаются при повреждении. Эпителиальная, соединительная, неисчерченная (гладкая) мышечная ткани регенерируют хорошо и быстро, исчерченная (поперечнополосатая) мышечная ткань восстанавливается лишь при определенных условиях, а в нервной ткани восстанавливаются лишь нервные волокна. Восстановление тканей при их повреждении называется репаративной регенерацией.
1. Эпителиальная ткань
Эпителиальная ткань (эпителий) покрывает поверхность тела, выстилает слизистую оболочку внутренней поверхности полых органов (желудок, кишечник, мочевыводящие пути и др.), серозные оболочки (плевра, перикард, брюшина) и образует железы. В связи с этим различают покровный эпителий и железистый эпителий. Находясь на границе внешней и внутренней среды организма, покровный эпителий является пограничной тканью и выполняет защитную функцию и функцию обмена веществ между организмом и окружающей его средой. Так, неповрежденный эпителий непроницаем для микроорганизмов и многих ядовитых веществ; через кишечный эпителий из полости кишечника осуществляется всасывание продуктов переваривания белков, жиров и углеводов в кровь и лимфу. Железистый эпителий, образующий железы, обладает способностью выделять вещества -- секреты, которые либо выводятся во внешнюю среду, либо поступают в кровь и лимфу (гормоны). Способность клеток вырабатывать и выделять вещества, необходимые для жизнедеятельности организма, называется секрецией. В связи с этим такой эпителий получил также название секреторного эпителия.
Эпителий представляет собой пласт клеток. В зависимости от развития и функции он имеет разное строение. Клетки эпителия располагаются на базальной мембране, которой он отделен от подлежащей рыхлой соединительной ткани. Эти клетки обладают полярностью, т. е. по-разному устроены их базальные и верхушечные отделы, и высокой способностью к регенерации.
С учетом морфологических и функциональных особенностей выделяют эпидермальный, или кожный, энтодермальный, или кишечный, и другие типы эпителия.
В основу классификации эпителия положены как отношение клеток к базальной мембране (все клетки однослойного эпителия прилежат к базальной мембране, а клетки многослойного располагаются в несколько слоев), так и форма эпителиальных клеток. Если в эпителии протекают процессы ороговения, т. е. верхние слои клеток превращаются в роговые чешуйки, то такой многослойный эпителий называется ороговевающим. Многослойный эпителий, характер строения которого меняется в зависимости от растяжения стенки органа при его наполнении, носит название переходного.
Клетки эпителия -- эпителиоциты -- имеют разную форму. Они состоят из ядра, цитоплазмы, оболочки и специальных структур, обусловленных функциональными особенностями различных видов эпителия. В цитоплазме обнаружены все виды органелл: эндоплазматическая сеть, митохондрии, центрисома, комплекс Гольджи. Ядро клетки круглое, овальное или дискообразное, в большинстве клеток оно одно. В эпителиальных клетках выделяют две части: базальную, направленную в сторону подлежащей ткани, и апикальную, обращенную к свободной поверхности. В базальной части лежит ядро, в апикальной -- органеллы, различные включения и специальные структуры, к которым относятся микроворсинки -- мельчайшие многочисленные выросты цитоплазмы на свободной поверхности клетки. Всасывающая и щеточная каемки характерны для эпителия, через который происходят процессы всасывания (кишечный, почечный эпителий). Реснички -- подвижные структуры на свободной поверхности клеток мерцательного эпителия. Благодаря их движению создается ток жидкости в полостях, выстланных эпителием. Реснички представляют собой выросты цитоплазмы с проходящими в них нитями, покрытыми клеточной мембраной. В цитоплазме клеток эпителия находятся тонофибриллы -- нитчатые структуры, обусловливающие, по-видимому, прочность клеток эпителия.
Однослойный плоский эпителий выстилает поверхность серозных оболочек брюшины, плевры, перикарда и называется мезотелием. Он является производным среднего зародышевого листка -- мезодермы -- и выстилает вторичную полость тела -- целом. Через него происходят обменные процессы между жидкостью, находящейся в полости брюшины, плевры и перикарда, и кровью, наполняющей сосуды, лежащие под мезотелием в соединительной ткани. Эндотелий представляет собой непрерывный слой клеток, покрывающий внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов. Форма и величина клеток эндотелия -- эндотелиоцитов -- различны. Обычно это плоские, вытянутые по длине сосуда клетки, способные делиться. По развитию они являются производными мезенхимы, а по строению имеют много общего с эпителием.
Однослойный кубический эпителий выстилает канальцы почек, выводные протоки желез и мелкие бронхи, призматический эпителий -- главным образом внутреннюю поверхность желудка, кишечника, желчного пузыря, желчных протоков и протока поджелудочной железы. В органах, в которых происходят процессы всасывания, клетки имеют всасывающую каемку, состоящую из большого числа микроворсинок. Развивается однослойный столбчатый эпителий из эндодермы и мезодермы. Однослойный многорядный мерцательный эпителий представлен клетками различной формы с ядрами, расположенными на разном уровне, т.е. в несколько рядов, и ресничками. Он выстилает дыхательные пути и некоторые отделы половой системы.
Многослойный плоский неороговевающий эпителий выстилает роговицу глаза, полость рта и пищевода. Он состоит из базального слоя, слоя шиповатых и слоя плоских клеток. Плоские клетки отмирают и постепенно отпадают с поверхности эпителия.
Многослойный плоский ороговевающий эпителий называется эпидермисом, он покрывает поверхность кожи. Эпидермис состоит из многих десятков слоев клеток. Процесс превращения клеток в роговые чешуйки на поверхности кожи сопровождается гибелью клеток, разрушением их ядра и цитоплазмы и накоплением в них кератина. Эпителий кожи подвержен влияниям внешней среды.
Поэтому в нем имеется ряд приспособлений в виде межклеточных мостиков, тонофибрилл и ороговевающих слоев клеток.
Переходный эпителий характерен для органов мочевыделительной системы, стенки которых растягиваются при заполнении мочой. Он состоит из двух слоев -- базального и покровного.
В связи со своим пограничным положением покровный эпителий часто подвергается повреждениям, но он способен быстро восстанавливаться. Восстановление эпителия происходит путем митотического деления клеток. В однослойном эпителии все клетки могут делиться, а в многослойном этим свойством обладают лишь клетки базального и шиповатого слоев. При повреждении эпителия восстановление его происходит за счет? интенсивного размножения клеток по краям раны. Размножающиеся клетки надвигаются на поврежденное место. Эпителизация раны происходит после того, как она заполнится богатой сосудами соединительной тканью, называемой грануляционной.
2. Железы
Железы выполняют в организме секреторную функцию. Выделяемые ими вещества имеют значение для процессов, протекающих в организме. Часть желез является самостоятельными органами (например, околоушная слюнная железа, поджелудочная железа), другие входят в состав органов (например, железы стенки желудка). Большинство желез -- производные эпителия. Различают железы внешней секреции -- экзокринные и железы внутренней секреции -- эндокринные, не имеющие протоков и выделяющие гормоны непосредственно в кровь. Эндокринные железы участвуют в регуляции процессов, протекающих в органах и тканях. Железы внешней секреции выделяют секрет в различные полости (например, в полость желудка, кишки и др.) или на поверхность кожи. Экзокринные железы выполняют различные функции в зависимости от того, в состав каких органов и систем они входят. Например, железы пищеварительного тракта выделяют секрет, необходимый для процессов пищеварения. Эти железы отличаются друг от друга местом расположения, строением, типом секреции (способ образования секрета) и составом секрета. Экзокринные железы очень разнообразны, большинство из них многоклеточные. Одноклеточные железы (бокаловидные клетки) расположены в эпителии дыхательных путей и кишечника и вырабатывают слизь. В многоклеточных железах различают секреторный отдел и выводной проток. Секреторный отдел состоит из клеток, вырабатывающих секрет (гландулоциты). В зависимости от того, ветвятся или нет их выводные протоки, выделяют сложные и простые железы. По форме секреторного отдела различают трубчатые, альвеолярные и трубчато-альвеолярные железы.
На основании того, как образуется секрет и каким путем он выделяется из клеток, различают мерокринные, апокринные и голокринные железы. Мерокринные железы (наиболее часто встречающиеся) выделяют секрет в выводной проток без разрушения цитоплазмы секреторных клеток. Апокринные железы характеризуются частичным разрушением цитоплазмы секреторных клеток. В процессе секреции апикальная часть клетки разрушается и входит в состав секрета. В последующие стадии разрушенная клетка восстанавливается. Такой тип секреции характерен для молочных и некоторых потовых желез. В голокринных железах выделение секрета сопровождается гибелью клеток. Разрушенные клетки являются секретом железы. У человека такого рода железами являются сальные. По характеру секрета различают железы слизистые, белковые, смешанные (белково-слизистые) и сальные.
3. Соединительная ткань
К соединительной ткани относят волокнистую, соединительные ткани со специальными свойствами и скелетную (хрящевая и костная). Соединительная ткань образована клетками и большим количеством межклеточного вещества, которое состоит из волокон и основного вещества.
К волокнистой соединительной ткани относят рыхлую, неоформленную плотную и оформленную плотную (сухожилия, фиброзные перепонки, пластинчатая и эластическая ткани). Соединительная ткань с особыми свойствами представлена ретикулярной, жировой, слизистой и пигментной.
Соединительная ткань выполняет трофическую функцию, связанную с питанием клеток и их участием в обмене веществ, защитную (фагоцитоз, выработка иммунных тел), механическую (образует строму органов, связывает их между собой, образует фасции и др.), пластическую (участвует в процессах регенерации, заживления ран) функции. При некоторых патологических состояниях соединительная ткань может участвовать в кроветворении, так как ее клетки могут давать начало элементам крови.
Рыхлая волокнистая соединительная ткань. Эта ткань состоит из клеток и межклеточного вещества, в котором волокна расположены рыхло и имеют разное направление. Она сопровождает кровеносные сосуды и нервы, входит в состав органов, образуя их строму. Межклеточное вещество содержит коллагеновые (клейдающие), эластические волокна и основное вещество.
Коллагеновые волокна представляют собой прямые или волнообразно изогнутые тяжи толщиной 1 --12 мкм, состоящие из еще более тонких нитей -- фибрилл. Они способны набухать и очень прочны. Эластические волокна представляют собой ветвящиеся нити разного диаметра. Их можно обнаружить при специальной окраске гистологических препаратов. В рыхлой волокнистой соединительной ткани они образуют широкопетлистую сеть. Помимо этих двух видов волокон, в рыхлой соединительной ткани встречаются также ретикулярные, или аргирофильные, волокна, получившие свое название благодаря тому, что они хорошо окрашиваются солями серебра и образуют сеть. Они входят в состав стромы лимфатических узлов, селезенки, костного мозга и т. д.
Основное вещество соединительной ткани представляет собой однородную массу и является коллоидом. В его состав входят мукополисахариды (гиалуроновая кислота, гепарин и др.), которые обусловливают морфологические и функциональные особенности основного вещества. Клеточные элементы соединительной ткани представлены малодифференцированными клетками, фибробластами, макрофагоцитами (макрофаги), тканевыми базофилами, плазмоцитами, липоцитами и пигментоцитами. Кроме того, в соединительной ткани встречаются клетки крови (лейкоциты).
Во взрослом организме все время происходит смена клеток. Отмирающие клетки заменяются новыми за счет размножения себе подобных. Кроме того, в соединительной ткани имеются клетки, способные превращаться в другие клеточные формы. Такие клетки называются малодифференцированными. К ним относятся клетки, расположенные по ходу кровеносных капилляров,-- адвентициальные, или периваскулярные (перициты). Такими же являются ретикулярные клетки и лимфоциты. Они играют большую роль не только в процессах физиологического восстановления ткани, но и при разных патологических состояниях (воспаление, нарушение кроветворения и др.). Фибробласты -- плоские, веретенообразные клетки, широко представлены в соединительной ткани. Они подвижны и способны делиться; могут возникать из малодифференцированных форм и превращаться в другие клетки. Фибробласты принимают участие в образовании основного вещества и коллагеновых волокон. При патологических состояниях они участвуют в заживлении ран и образовании рубцовой ткани и соединительнотканной капсулы вокруг инородных тел. Фибробласты, закончившие цикл развития, называются фиброцитами.
Макрофагоциты (макрофаги) -- клетки, способные к фагоцитозу и перевариванию захваченных частиц накоплению в цитоплазме коллоидных частиц. Различают свободные и оседлые макрофаги. Оседлые макрофаги (гистиоциты, блуждающие клетки в покое) встречаются в участках, богато снабженных кровеносными сосудами, а также в местах скопления жировых клеток. Они лежат поодиночке или небольшими группами, изолированно друг от друга и от других клеток и способны передвигаться. При различных раздражениях организма или при возникновении очага воспаления появляются свободные макрофаги -- полибласты. Подвижные фагоцитирующие полибласты возникают из оседлых макрофагов, малодифференцированных клеток, лимфоцитов и моноцитов. Размеры и форма их различны. Макрофаги уничтожают микроорганизмы, в них нейтрализуются токсические вещества, вырабатываются иммунные тела.
Тканевые базофилы (тучные клетки) представляют собой неправильной формы клетки с отростками и характерной зернистостью цитоплазмы. Она шириной 3,5-- 14,0 мкм и длиной 22 мкм; вырабатывают гепарин препятствующий свертыванию крови. Количество их увеличивается при некоторых заболеваниях.
Плазмоциты (плазматические клетки) встречаются в рыхлой соединительной ткани слизистой оболочки кишки сальника, различных желез, в лимфатических узлах и костном мозге. При некоторых патологических состояниях их количество резко увеличивается. Они разной формы и величины и могут возникать из лимфоцитов, ретикулярных клеток, макрофагов и др. Плазматические клетки участвуют в образовании антител, а также в обмене белка. Липоциты (жировые клетки) обладают способностью накапливать резервный жир. Они встречаются в рыхлой соединительной ткани поодиночке или группами около кровеносных сосудов. Когда липоциты скапливаются в большом количестве, вытесняя другие клетки, говорят о жировой ткани. Жировые клетки шаровидные, обычно каждая клетка содержит каплю нейтрального жира, занимающую всю центральную часть клетки. Количество жировых клеток в соединительной ткани сильно варьирует Они чаще всего образуются из адвентициальных клеток сопровождающих кровеносные капилляры.
Пигментоциты (пигментные клетки) -- вытянутые клетки с короткими, непостоянной формы отростками. Их цитоплазма содержит зерна пигмента меланина. В рыхлой соединительной ткани они встречаются в коже вокруг заднего прохода, в коже мошонки и сосков молочных желез. Их очень много в сосудистой оболочке глаза.
Плотная волокнистая соединительная ткань. В зависимости от расположения волокон эта ткань подразделяется на неоформленную и оформленную. Резкой границы между рыхлой и плотной неоформленной соединительной тканью провести невозможно. В последней меньше основного вещества, коллагеновые волокна и сеть эластических волокон плотно прилежат друг к другу, переплетаются, напоминая войлок. Клеточных элементов в ней мало. В оформленной плотной волокнистой соединительной ткани пучки коллагеновых волокон расположены в определенном направлении, соответственно механическим условиям, в которых функционирует орган. Она образует сухожилия мышц, связки, перепонки и пластинчатую соединительную ткань, покрывающую некоторые органы (периневрий, пластинчатые тельца и др.) Некоторые связки (желтые связки позвоночного столба, голосовые связки и др.) и мембраны в стенках полых органов и сосудов образованы эластической тканью, содержащей большое количество эластических волокон.
Соединительная ткань с особыми свойствами. Ретикулярная ткань состоит из ретикулярных клеток и ретикулярных волокон. Ретикулярные клетки имеют отростки, которыми они соединяются друг с другом, образуя сеточку (reticulum; отсюда название ткани). Ретикулярные волокна располагаются во всех направлениях. Ретикулярные волокна располагаются во всех направлениях. Ретикулярная ткань составляет остов костного мозга, лимфатических узлов и селезенки, а также встречается в слизистой оболочке кишечника, в почках и т. д. Ретикулярные клетки способны превращаться в клетки других, видов (гемоцитобласты, макрофаги, фибробласты и др.).
Ретикулоэндотелиальной системой (система макрофагов) называют совокупность всех клеток организма, способных захватывать из жидкой среды частицы коллоида и взвесей и откладывать их в цитоплазме. Такие клетки служат для уничтожения вредных для организма агентов, поступающих извне или появляющихся местно, внутри организма. Они играют важную роль в образовании иммунитета. К таким клеткам относятся макрофаги, фагоцитирующие ретикулярные клетки кроветворных органов, звездчатые клетки синусоидных кровеносных капилляров печени и др. Впервые эти клетки в единую систему объединил И. И. Мечников.
Жировая ткань является местом накопления запасных питательных веществ, поэтому ее количество меняется в зависимости от питания организма. У человека жировая ткань образует подкожный слой, находится в сальнике, брыжейке кишки, около почек и т. п. Обычно она делится прослойками рыхлой соединительной ткани на дольки. Жировые клетки содержат капли жира и чаще всего сферической или многоугольной формы. Между ними проходят коллагеновые и эластические волокна и располагаются фибробласты, тучные клетки и лимфоциты. В жировой ткани протекают активные процессы обмена веществ, в частности образования жира из углеводов.
Слизистая, или студенистая, соединительная ткань встречается только у зародыша, в частности в пупочном канатике человека. Межклеточное вещество этой ткани однородно и напоминает желе.
Пигментной тканью называют ткань, в которой содержится много пигментных клеток -- меланоцитов.
Хрящевая ткань. Эта ткань состоит из особых клеток -- хондроцитов, окруженных большим количеством межклеточного вещества. В зависимости от строения межклеточного вещества различают гиалиновый, эластический и волокнистый хрящ.
Гиалиновый хрящ состоит их хрящевых клеток, которые лежат в особых полостях в межклеточном веществе, обычно группами. Клетки разнообразной формы, чаще округлые или овальные. Межклеточное вещество прозрачное и состоит из коллагеновых волокон и основного вещества. Хрящ во взрослом организме образует хрящевую часть ребер, покрывает поверхности сочленяющихся костей и образует остов дыхательных путей. С возрастом наблюдаются уменьшение количества хрящевых клеток и изменение химического состава межклеточного вещества, в результате чего в нем откладываются соли кальция и происходит обызвествление хряща.
Эластический хрящ у человека образует ушную раковину, некоторые хрящи гортани и др., имеет желтоватый цвет и менее прозрачен, чем гиалиновый. В межклеточном веществе имеется большое количество эластических волокон. В нем никогда не происходит процесс обызвествления.
Волокнистый хрящ образует межпозвоночные диски, лобковый симфиз и выстилает суставные поверхности височно-нижнечелюстного, грудинно-ключичного и некоторых других суставов. Его межклеточное вещество содержит большое количество коллагеновых волокон.
Надхрящница покрывает хрящ по поверхности. Ее внутренний слой содержит особые клетки -- хондробласты, из которых развиваются хрящевые клетки -- хондроциты, в результате чего происходит рост хряща.
Костная ткань. Образуется из клеток остеоцитов межклеточного вещества, состоящего из волокон и основного вещества, содержащего неорганические соли, что делает ее крепкой.
В костной ткани постоянно происходит разрушение и созидание кости. Физиологические свойства костной ткани могут меняться с возрастом, в зависимости от питания, мышечной деятельности, при нарушении деятельности эндокринных желез и иннервации. Коллагеновые волокна костной ткани получили название оссеиновых (os -- кость); они выявляются на гистологических препаратах при специальной обработке. Неорганические вещества представлены главным образом солями кальция, образующими сложные соединения, придающие кости прочность. Органическое вещество кости -- оссеин -- делает кость гибкой и эластичной. Сочетание этих свойств создает ту прочность и легкость, которая необходима для опорной ткани. В межклеточном веществе костной ткани располагаются плоские, овальной формы полости, получившие название костных полостей. Они соединяются костными канальцами. В костной ткани встречается три вида клеток: остеобласты, остеоциты и остеокласты.
Остеобласты -- клетки, образующие костную ткань. Встречаются в местах разрушения и восстановления костной ткани. В развивающейся кости их очень много.
Остеоциты образуются из остеобластов и имеют отростки. Тела остеоцитов лежат в костных полостях, а отростки заходят в костные канальцы. Система костных канальцев создает условия для обмена веществ между остеоцитами и тканевой жидкостью.
Остеокласты -- это большие многоядерные клетки с отростками. Они принимают участие в разрушении кости и обызвествленного хряща с образованием бухты или лакуны.
Различают два вида костной ткани -- грубоволокнистую и пластинчатую. К ней относят также и дентин зубов.
В грубоволокнистой костной ткани коллагеновые волокна образуют хорошо заметные пучки, между которыми в костных полостях лежат остеоциты. У человека эта ткань встречается лишь в процессе развития костей у зародыша, а у взрослых -- в швах черепа и у мест прикрепления к костям сухожилий.
Пластинчатая, или тонковолокнистая, костная ткань содержит коллагеновые волокна, расположенные параллельными пучками внутри пластинок или между ними. Пластинчатая костная ткань образует все кости скелета человека.
Дентин не имеет костных клеток. Тела клеток лежат вне дентина, а их отростки проходят в канальцах внутри него. Эти клетки напоминают остеобласты и называются одонтобластами.
Кость. Пластинчатая костная ткань образует компактное и губчатое костное вещество, что составляет кость. В компактном костном веществе костные пластинки располагаются в определенном порядке и придают веществу большую плотность. В губчатом веществе пластинки внутри кости образуют перекладины разной формы, располагающиеся в зависимости от функции кости.
Из компактного вещества состоит главным образом средняя часть длинных трубчатых костей (тело, или диафиз), а губчатое вещество образует их концы, или эпифизы, а также короткие кости; в плоских костях имеется то и другое вещество.
В компактном костном веществе костные пластинки образуют своеобразные трубчатые системы -- остеоны. Остеон является структурной единицей кости. Костные пластинки концентрически расположены вокруг кровеносных сосудов; обычно их 5--20 толщиной 3--7 мкм. Такая конструкция придает кости особую прочность. Полость в центре остеона, в которой проходит сосуд, называется центральным каналом остеона (гаверсов канал). Каналы соединяются друг с другом, а сосуды -- между собой, с сосудами костного мозга, расположенного внутри кости, и с сосудами надкостницы. Между остеонами костные пластинки идут в разных направлениях и носят название вставочных, или промежуточных. Снаружи и изнутри кости пластинки располагаются концентрически. Каналы, по которым проходят сосуды из надкостницы в кость, называются питательными. Надкостницу с костью соединяют коллагеновые волокна, которые называются прободающими, или шарпеевскими, волокнами.
Снаружи кость покрыта надкостницей (периост). Она состоит из двух слоев соединительной ткани. Внутренний слой содержит много коллагеновых и эластических волокон, а также остеокласты и остеобласты. В период роста и остеобласты надкостницы принимают участие в костеобразовании. Наружный слой построен из более плотной соединительной ткани, к нему прикрепляются связки и сухожилия мышц. Надкостница содержит большое количество сосудов и нервов.
Эндостом называется оболочка, покрывающая кость со стороны костномозгового канала. При повреждениях и переломах кости происходит ее восстановление (регенерация) за счет надкостницы, которая, разрастаясь над местом перелома, соединяет концы сломанной кости, образуя вокруг них муфту из костной ткани, получившую название костной мозоли.
4. Мышечная ткань
Двигательные процессы в организме человека и животного обусловлены сокращением мышечной ткани, обладающей сократительными структурами. К мышечной ткани относят неисчерченную (гладкую) и исчерченную (поперечнополосатую) мышечную ткань, включающую скелетную и сердечную. Сократительными элементами являются мышечные фибриллы -- миофибриллы (мышечные нити). На электронных микрофотографиях в составе миофибрилл различают более тонкие протофибриллы или миофиламенты разной толщины. Сокращение скелетных мышц влечет за собой перемещение тела в пространстве, обусловливает движение его частей; сокращение неисчерченной мышечной ткани приводит к изменению объема органов, напряжению их стенок и т. д. Обязательным условием работы мышц является их прикрепление к опорным элементам, в результате чего при сокращении мышечной ткани они приходят в движение.
Неисчерченная (гладкая) мышечная ткань имеет клеточное строение. Мышечная клетка -- миоцит -- веретенообразная, с заостренными концами. В ней есть ядро, цитоплазма (саркоплазма), органеллы и оболочка (сарколемма). Сократительные миофибриллы располагаются по периферии клетки вдоль ее оси. Миоциты плотно прилежат друг к другу. Опорным аппаратом в гладкой мышечной ткани являются тонкие коллагеновые и эластические волокна, расположенные вокруг клеток и связывающие их между собой.
Неисчерченная мышечная ткань сокращается медленно и способна длительно находиться в состоянии сокращения, потребляя относительно малое количество энергии и не утомляясь. Такой тип сократительной деятельности называется тоническим. Гладкая мышечная ткань в отличие от скелетной не подчиняется сознанию. Этот вид ткани входит в состав стенок различных внутренних органов (желудок, кишечник, мочевой пузырь, матка и др.), кровеносных сосудов и кожи.
Исчерченные мышечные волокна представляют собой вытянутые цилиндрические образования с округлыми или заостренными концами, которыми волокна прилежат друг к другу или вплетаются в соединительную ткань сухожилий и фасций. У человека такие волокна имеют длину от нескольких миллиметров до 10 см и больше, диаметр их 12--70 мкм. Сократительным аппаратом их являются поперечнополосатые миофибриллы, которые образуют пучок волоконец, идущих от одного до другого конца мышечного волокна. Поперечная исчерченность миофибрилл объясняется чередованием участков с разными физико-химическими и оптическими свойствами. Одинаковые участки миофибрилл располагаются в волокне на одном и том же уровне, что обусловливает поперечную исчерченность всего волокна. С помощью электронного микроскопа установлено, что в состав миофибрилл входят тончайшие волоконца -- миофиламенты (протофибриллы). Мышечные волокна содержат большое количество ядер (от нескольких десятков до многих сотен), саркосомы, сходные с митохондриями других клеток, саркоплазму и покрыты сарколеммой. Скелетные мышцы богаты соединительной тканью, которая образует тонкую сеть между мышечными волокнами -- эндомизий.
Исчерченная мышечная ткань образует скелетные мышцы, мышцы рта, глотки, частично пищевода и ряд других мышц. В разных отделах эта ткань имеет свои особенности. Большая часть мышечных волокон скелетных мышц обладает высокой скоростью сокращения и быстрой утомляемостью. Этот тип сократительной деятельности называется тетаническим. Исчерченная мышечная ткань сокращается произвольно в ответ на импульсы, идущие от коры полушарий большого мозга. Однако часть мышц (межреберные, диафрагма и др.), кроме того, сокращается без участия сознания под влиянием импульсов из дыхательного центра, а мышцы глотки и пищевода сокращаются непроизвольно.
Плотная соединительная ткань, покрывающая мышцу снаружи, носит название наружного перимизия. Она проникает в глубь мышцы и проходит между пучками мышечных волокон. Это внутренний перимизий. В нем расположены сосуды и нервы. Связь мышц с сухожилиями осуществляется за счет коллагеновых волокон, оплетающих мышечное волокно и соединенных с сарколеммой.
Сердечная исчерченная мышечная ткань образует мышечную оболочку сердца -- миокард. Она образована сердечными мышечными клетками -- кардиомиоцитами. С помощью вставочных дисков эти клетки соединяются в мышечные комплексы, или сердечные мышечные волокна. Такая система соединений обеспечивает сокращение миокарда как единого целого. Атипичные кардиомиоциты образуют проводящую систему сердца.
Исчерченная (поперечнополосатая) мышечная ткань развивается из мезодермы. Клетки, из которых развиваются мышечные волокна, называются миобластами. В определенных условиях мышечная ткань может восстанавливаться, однако, если благоприятные условия отсутствуют, мышечная ткань замещается соединительной тканью, образующей рубец.
эпителий железа ткань клетка
5. Нервная ткань
Нервная ткань является основным компонентом нервной системы. Она состоит из нервных клеток и клеток нейроглии. Нервные клетки способны под действием раздражения приходить в состояние возбуждения, вырабатывать импульсы и передавать их. Эти свойства определяют специфическую функцию нервной системы. Нейроглия органически связана с нервными клетками и осуществляет трофическую, секреторную, защитную функции и функцию опоры.
Нервные клетки -- нейроны, или нейроциты, представляют собой отростчатые клетки. Размеры тела нейрона колеблются в значительных пределах (от 3--4 до 130 мкм). По форме нервные клетки также очень разные. Отростки нервных клеток проводят нервный импульс из одной части тела человека в другую, длина отростков от нескольких микрон до 1,0--1,5 м.
Различают два вида отростков нервной клетки. Отростки первого вида проводят импульсы от тела нервной клетки к другим клеткам или тканям рабочих органов, они называются нейритами, или аксонами. Нервная клетка имеет всегда только один аксон, который заканчивается концевым аппаратом на другом нейроне или в мышце, железе. Отростки второго вида называются дендритами, они древовидно ветвятся. Их количество у разных нейронов различно. Эти отростки проводят нервные импульсы к телу нервной клетки. Дендриты чувствительных нейронов имеют на периферическом конце специальные воспринимающие аппараты -- чувствительные нервные окончания, или рецепторы.
По количеству отростков нейроны делятся на биполярные (двухполюсные) -- с двумя отростками, мультиполярные (многополюсные) -- с несколькими отростками. Особо выделяют псевдоуниполярные (ложные однополюсные) нейроны, нейрит и дендрит которых начинаются от общего выроста тела клетки с последующим Т-образным делением. Такая форма характерна для чувствительных нейроцитов.
Нервная клетка имеет одно ядро, содержащее 2--3 ядрышка. Цитоплазма нейронов, помимо органелл, характерных для любых клеток, содержит хроматофильное вещество (вещество Ниссля) и нейрофибриллярный аппарат. Хроматофильное вещество представляет собой зернистость, образующую в теле клетки и дендритах не резко ограниченные глыбки, окрашивающиеся основными красителями. Оно меняется в зависимости от функционального состояния клетки. В условиях перенапряжения, травмы (перерезка отростков, отравление, кислородное голодание и др.) глыбки распадаются и исчезают. Этот процесс получил название хроматолиза, т. е. растворения.
Другим характерным компонентом цитоплазмы нервных клеток являются Тонкие нити - нейрофибриллы. В отростках они лежат вдоль волокон параллельно друг пруту, в теле клетки образуют сеть.
Нейроглия представлена клетками различной формы и величины, которые делятся на две группы: макроглию (глиоциты) и микроглию (глиальные макрофаги). Среди глиоцитов различают эпендимоциты, астроциты и олигодендроциты. Эпендимоциты выстилают спинномозговой канал и желудочки головного мозга. Астроциты образуют опорный аппарат центральной нервной системы. Олигодендроциты окружают тела нейронов в центральной и периферической нервной системе, образуют оболочки нервных волокон и входят в состав нервных окончаний. Клетки микроглии подвижны и способны фагоцитировать.
Нервными волокнами называются отростки нервных клеток (осевые цилиндры), покрытые оболочками. Оболочка нервных волокон (нейролемма) образована клетками, которые называются нейролеммоцитами (шванновские клетки). В зависимости от строения оболочки различают безмиелиновые (безмякотные) и миелиновые (мякотные) нервные волокна. Безмиелиновые нервные волокна характеризуются тем, что леммоциты в них лежат плотно друг к другу и образуют тяжи протоплазмы. В такой оболочке располагаются один или несколько осевых цилиндров. Миелиновые нервные волокна имеют более толстую. оболочку, внутренняя часть которой содержит миелин. При обработке осмиевой кислотой гистологических препаратов миелиновая оболочка окрашивается в темно-коричневый цвет. На определенном расстоянии в миелиновом волокне расположены косые белые линии -- насечки миелина и сужения -- узлы нервного волокна (перехваты Ранвье). Они соответствуют границам леммоцитов. Миелиновые волокна толще безмиелиновых, их диаметр 1-20 мкм.
Пучки миелиновых и безмиелиновых нервных волокон, покрытые соединительнотканной оболочкой, образуют нервные стволы, или нервы. Соединительнотканная оболочка нерва называется эпиневрием. Она проникает в толщу нерва и покрывает пучки нервных волокон (периневрий) и отдельные волокна (эндоневрий). В эпиневрии располагаются кровеносные и лимфатические сосуды, которые проходят в периневрий и эндоневрий.
Перерезка нервных волокон вызывает дегенерацию периферического отростка нервного волокна, при которой он распадается на участии различной величины. На месте перерезки возникает воспалительная реакция и образуется рубец, через который в дальнейшем возможно прорастание центральных отрезков нервных волокон при регенерации (восстановлении) нерва. Регенерация нервного волокна начинается с интенсивного размножения леммоцитов и образования из них своеобразных лент, проникающих в рубцовую ткань. Осевые цилиндры центральных отростков образуют на концах утолщения -- колбы роста и врастают в рубцовую ткань и ленты леммоцитов. Периферический нерв растет со скоростью 1--4 мм/сут.
Нервные волокна заканчиваются концевыми аппаратами-- нервными окончаниями. По функции различают три группы нервных окончаний: чувствительные, или рецепторы, двигательные и секреторные, или эффекторы, и окончания на других нейронах -- межнейрональные синапсы.
Чувствительные нервные окончания (рецепторы) образованы концевыми, разветвлениями дендритов чувствительных нейронов. Они воспринимают раздражения из внешней среды (экстерорёцепторы) и от внутренних органов (интерорецепторы). Различают свободные нервные окончания, состоящие только из концевого ветвления отростка нервной клетки, и несвободные, если в образовании нервного окончания принимают участие элементы нейроглии. Несвободные нервные окончания могут быть покрыты соединительнотканной капсулой. Такие окончания называются капсулированными: например, пластинчатого тельца (тельца Фатера--Пачини). Рецепторы скелетных мышц называются нервно-мышечными веретенами. Они состоят из нервных волокон, ветвящихся на поверхности мышечного волокна в виде спирали.
Эффекторы бывают двух типов -- двигательные и секреторные. Двигательные (моторные) нервные окончания являются концевыми разветвлениями нейритов двигательных клеток в мышечной ткани и называются нервно-мышечными окончаниями. Секреторные окончания в железах образуют нервно-железистые окончания. Названные виды нервных окончаний представляют собой нервно-тканевой синапс.
Связь между нервными клетками осуществляется при помощи синапсов. Они образованы концевыми ветвлениями нейрита одной клетки на теле, дендритах или аксонах другой. В синапсе нервный импульс проходит только в одном направлении (с нейрита на тело или дендриты другой клетки). В различных отделах нервной системы они устроены по-разному.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Виды эпителиальной ткани. Однослойный плоский эпителий. Мерцательный или реснитчатый, цилиндрический эпителий. Основные виды и функции соединительной ткани. Овальные тучные клетки, фибробласты. Плотная соединительная ткань. Функции нервной ткани.
презентация , добавлен 05.06.2014
Функции крови, ее форменные элементы. Атипичные формы эритроцитов. Рыхлая неоформленная волокнистая соединительная ткань, ее функции. Общая особенность плотной волокнистой соединительной ткани. Ретикулярные клетки и волокна. Назначение эндотелия.
контрольная работа , добавлен 17.06.2014
Общая характеристика и свойства эпителиев. Комплексная классификация эпителиев высших позвоночных: базальная мембрана, покровный эпителий кожи. Специализированные клетки эпидермиса, их особенности и выполняемые функции. Эпителий слизистых оболочек.
лекция , добавлен 09.12.2010
Основные положения гистологии, которая изучает систему клеток, неклеточных структур, обладающих общностью строения и направленных на выполнение определенных функций. Анализ строения, функций эпителия, крови, лимфы, соединительной, мышечной, нервной ткани.
реферат , добавлен 23.03.2010
Изучение понятия соединительной ткани, которая составляет примерно 50% от массы тела. Рыхлая, плотная соединительная ткань, хрящ, кость, кровь. Строение соединительной ткани по Слуцкому. Межклеточный органический матрикс соединительной ткани. Коллаген.
презентация , добавлен 02.12.2016
Виды, функции и особенности тканей. Эпителиальная, соединительная и нервная ткань. Понятие и функции клетки. Связь человека и всех живых существ между собой соединительными структурами. Питание и обмен веществ клетки. Кровь как внутренняя среда организма.
конспект урока , добавлен 22.01.2011
Процессы анаболизма и катаболизма в организме, обмен энергией. Происхождение разновидностей мерцательного эпителия, особенности их строения. Костная ткань, костные клетки (остеоциты). Отличие строения мякотного нервного волокна от безмякотного.
контрольная работа , добавлен 21.11.2010
Функции и строение эпителия, регенерация его клеток. Типы соединительной ткани, преобладание межклеточного вещества над клетками. Химический состав и физические свойства межклеточного вещества. Костная, жировая, хрящевая, мышечная и нервная ткани.
реферат , добавлен 04.06.2010
Уровень клеточной организации, промежуточное отношение клеток и всего организма. Основные группы тканей. Мышечная, нервная, эпителиальная и соединительная ткань. Состав слизистых оболочек. Верхушечная, боковая и вставочные меристемы растительных тканей.
презентация , добавлен 11.05.2012
Изучение видов тканей внутренней среды – комплекса тканей, образующих внутреннюю среду организма и поддерживающих ее постоянство. Соединительная ткань – главная опора организма. Трофическая, опорно-механическая, защитная функция ткани внутренней среды.
Окрашивание нервной ткани
При морфологических исследованиях нервной ткани на светооптическом уровне применяют большое количество методов окрашивания, многие из которых модифицированы. Чаще всего это избирательные (элективные) методы, используемые для выявления одного или двух элементов. С определенной целью применяют комбинированные методы.
ФИКСАЦИЯ
При изучении нервной ткани из простых фиксаторов наиболее часто используют 10 - 20 % раствор формальдегида и 96 % и 100 % спирт, из фиксирующих смесей - сулему и пиридин. Существуют также специфические фиксаторы, применяющиеся только при исследовании элементов нервной ткани.
Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления глии):
нейтральный формалин 15 мл
бромид аммония 20 г
дистиллированная вода 85 мл
Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю -Хортеге.
Продолжительность фиксации тонких (до 1,5 см) кусочков материала 2 - 15 дней.
Промывание в проточной воде.
Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления нейро-фибрилл):
пиридин 40 мл
96 % спирт 30 мл
Продолжительность фиксации 2 ч.
Промывание в проточной воде в течение 1 ч.
ОБЕЗВОЖИВАНИЕ
Особенностью обработки нервной ткани является ее тщательное обезвоживание. Для обезвоживания кусочков толщиной 5 -б мм используют следующую схему:
50 % спирт 2 ч
70 % спирт 6 ч
80 % спирт 6 ч
96 % спирт 6 ч
100 % спирт I 6 ч
100% спирт II 6 ч
Продолжительность обезвоживания 32 ч
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЛИВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ
Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет.
Заливка в желатин по Снесареву
Метод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.
Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12,5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности.
После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12,5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 - 2 ч до 1 - 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5- 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.
ОКРАШИВАНИЕ НЕЙРОНОВ
Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,- тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.
Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».
Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl - фиксация препаратов этиловым спиртом - выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.
Метод Ниссля
Фиксация.
Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.
Получение срезов.
Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 - 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.
Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10-15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.
Окрашивание срезов.
Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла, 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.
Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).
==========================================================
Окраска по Нисслю
==========================================================
Упрощенный метод Ниссля
Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.
Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.
Методика окраски
1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.
2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.
3. Дифференцируют в 96 % спирте.
4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.
5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.
6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.
7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.
==========================================================
ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНЫХ ВОЛОКОН
Ускоренный метод Гольджи
1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2,5 % (до 3,5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 - 25 °С в коричневую склянку на стеклянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 - 6 кусочков. Кусочки не должны быть слишком большими или слишком маленькими (толщина 2 - 3 мм, площадь поверхности 5 - 10 мм2).
Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 - 7 дней с промежутками около 12 ч.
2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0,75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до прекращения образования осадка, затем помещают на 1 - 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0,75 % раствора нитрата серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.
3. Промывают в 40 % спирте (1 -2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 -4 ч, 4 % целлоидине 1 - 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.
Кусочки также можно поместить на 1-4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1:1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.
Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.
После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.
Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.
Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 -10-дневные животные). Особенно благоприятными объектами являются головной и спинной мозг птенцов голубя.
Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 - 5 дней, для глии 2 - 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.
Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.
Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 - 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 - 3 % раствора бихромата калия и 4 -5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.
Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.
При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 - 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80-100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 - 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.
==========================================================
Медленный метод Гольджи
Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 - 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0,75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.
Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом
Метод Гольджи-Дейнеки
(для выявления синапсов)
1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 % нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч.
2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2,5 мес.
3. Промывают в дистиллированной воде 3 - 4 мин.
4. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0,5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут.
5. Промывают в дистиллированной воде.
6. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь.
7. Переносят в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут).
8. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт.
9. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1,5 г тиосульфата натрия, 1,5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота).
10. Промывают 10 - 30 мин водопроводной, затем дистиллированной водой.
11. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 - 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты).
12. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавелевой кислоты на 1 - 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия).
13. Промывают дистиллированной водой и переносят в спирты восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %) по 2 -3 мин.
14. Проводят через карбол-ксилол 1-2 мин, 2 - 3 порции ксилола и заключают.
Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло-серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты - более интенсивно.
==========================================================
Методы Бильшовского
Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность - 3 - 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные!) и применение чистых реактивов.
Импрегнация срезов
Материал фиксируют в растворе формалина (1:9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 -3 ч, затем в дистиллированной воде 1-2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной.5 - 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 - 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 - 4 раза.
Импрегнация:
1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;
2) быстро (2 - 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;
3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного серебра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия - образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0,875 - 0,910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 - 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 - 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;
4) быстро проводят через 2 - 3 порции дистиллированной воды;
5) восстанавливают в растворе формалина (1:4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, - срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;
6) промывают в воде 15 мин;
7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 - 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;
8) фиксируют 1-2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;
9) тщательно промывают в обычной воде (1-2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.
На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.
К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1:9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.
==========================================================
Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином
В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 - 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24- 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.
Тотальная импрегнация
Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 - 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0,5 - 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 -24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.
Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.
1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1:4 до 1:9), разрезают на кусочки толщиной не более 0,5 см и на 3 - 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.
2. Промывают 12 - 24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.
3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3 - 5 дней.
4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.
5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).
6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).
7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1:9) 10 - 12 ч.
8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.
При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.
Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.
М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.
Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 - 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.
С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.
==========================================================
Метод Адэра и Витгилию
(для выявления нейрофибрилл и синапсов)
Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 - 24 ч. Срезы толщиной 15-20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).
Для усиления окраски срезы обрабатывают 3 - 4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в 6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5-10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.
Результат: хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.
==========================================================
Методы Рамон-и-Кахаля
Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.
Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.
В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.
Метод I.
Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.
1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 - 5 дней в 0,75 - 3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.
2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.
3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 - 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.
4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.
5. Заливают в целлоидин или парафин.
Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.
Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0,75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих-3 %, у беспозвоночных-6 % раствор. На 2-3 кусочка расходуют 80-100 мл раствора.
Метод II.
Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.
1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.
2. Разрезают на кусочки толщиной 2,5-3 мм, импрегнируют 5-7 дней в 1-1,5 % растворе нитрата серебра при 30-35 °С.
3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.
4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1-2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.
5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.
6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).
В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 - 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.
Метод III.
Особенно показан для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.
Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1-12 капель (для большого мозга 1-3 капли, мозжечка-4, спинного и продолговатого мозга-8-12, периферических окончаний - 2 -3) раствора аммиака (молекулярная масса 0,910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2-4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.
Метод IV.
Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.
Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 - 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.
Метод V.
Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).
Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12-24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.
Метод VI.
Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.
Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 - 24 ч в проточной воде и 2 - 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.
Метод Рамона-Лермитта
(выявление дегенерированных синапсов)
Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 - 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 - 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга - 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга - 60 мин, мозжечка и таламуса - 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.
1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).
2. Промывают в дистиллированной воде.
3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.
4. Переносят в 0,5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.
5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.
6. Промывают в дистиллированной воде (2 - 3 смены)
7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.
8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.
==========================================================
Методика Бильшовского
(выявление внутриклеточных нейрофибрилл,
МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГЛИИ
Методика Снесарева
(выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон)
Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках - феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию.
Материал фиксируют в 10 % формалине.
Срезы толщиной 8- 10 мкм получают на замораживающем микротоме.
1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 - 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя).
2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски.
3. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 -40 с.
4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа).
5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая-Грюнвальда на 3 - 5 с.
6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 - 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой.
7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.
Для приготовления 0,5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 - 3 ч в термостат при 37 - 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным).
Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки - ядро и прилежащая цитоплазма,- становится розовой: от яркого цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета.
Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая - Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8-10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.
==========================================================
Методика Рамон-и-Кахаля
(выявление волокнистой и астроцитарной глии)
Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 - 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.
1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).
2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.
Этапы окрашивания нервной ткани 1. Подготовка препарата Фиксация ü Обезвоживание ü Заливка ü Приготовление раствора ü 2. Окрашивание
Окрашивание нейронов. Метод Ниссля 1. 2. 3. 4. 5. 6. Фиксация Получение и окрашивание срезов Обезвоживавние Приготовление раствора Методика окрашивания Результат
Упрощенный метод Ниссля Фиксированный в спирте материал заливают в спирт целлоидин. Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время. Методика окраски 1. Расправленные срезы помещают в 0, 1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров. 2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте. 3. Дифференцируют в 96 % спирте. 4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом. 5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой. 6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают. 7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам. Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено
Окрашивание нервных волокон. Метод Шпильмейера Методика окраски 1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды. 2. Переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, и подсушивают на воздухе. 3. Погружают в 2, 5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2 сут (можно дольше) и держат в темном месте. 4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и обезжиривают в 96 % спирте 15 - 30 мин. 5. Помещают в гематоксилин (15 мл гематоксилина Бемера и 85 мл дистиллированной воды) на 1 сут и держат на свету. 6. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и дифференцируют в 2, 5 % растворе железоаммонийных квасцов (контролируя процесс под микроскопом). 7. Промывают в дистиллированной воде, затем оставляют на 30 мин в проточной воде. 8. Просушивают на воздухе, проводят через ксилол и заключают в бальзам. Результаты: на светлом слегка желтоватом фоне миелиновые волокна темно серо синеватого оттенка; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе того же оттенка.
Метод Хеквиста Методика окраски 1. Срезы проводят через 100 %, 96 %, 80 %, 70 % спирты и дистиллированную воду. 2. Переносят в 0, 5 % раствор фосфорно молибденовой кислоты на ночь. Одновременно готовят краситель (35 мл 1 % водного раствора метиленового синего + 35 мл 1 % водного раствора желтого или красного эозина, через 1 сут после приготовления растворы сливают и добавляют 120 мл воды). 3. Срезы быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят на ночь в краситель. 4. Ополаскивают в воде, быстро проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам. Результаты: на синем фоне ткани миелиновая оболочка нервных волокон приобретает окраску от розовой до ярко красной, осевые цилиндры окрашиваются в темно синий цвет.
Метод окрашивания синапсов Гольджи-Дейнеки 1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 %нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч. 2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2, 5 мес. . 3. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0, 5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут. 4. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь. 5. Переносят в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут). 6. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт. 7. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1, 5 г тиосульфата натрия, 1, 5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота). 8. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 - 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты). 9. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавелевой кислоты на 1 - 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия). 10. Проводят через карбол ксилол 1- 2 мин, 2 - 3 порции ксилола и заключают. Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты - более интенсивно.
Метод Глисса в модификации Владимировой 1. Небольшой кусочек ткани головного мозга погружают в жидкость Бодиана (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 90 мл 80 % спирта) на 3 - 4 дня. 2. Промывают в проточной воде в течение 24 ч. 3. Срезы толщиной 12 - 15 мкм получают на замораживающем микротоме, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают на 24 ч в 50 % спирт, добавив в него 10 капель крепкого аммиака. 4. Ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в 10 % раствор нитрата серебра на срок от нескольких часов до 5 дней (пока срез не станет коричневым). 5. Не ополаскивая, переносят в 10 % формалин, меняя его несколько раз, пока не исчезнет муть. 6. Ополаскивают в проточной воде. 7. Погружают на 30 с (можно до 1 мин) в смесь, состоящую из 10 мл 100 % спирта и 10 мл 20 % раствора нитрата серебра (выпадающий осадок растворяют аммиаком, прибавляя его по каплям). 8. Переносят в 10 % формалин, меняя несколько раз до исчезновения мути. 9. Промывают в дистиллированной воде и помещают в 1 % раствор хлорного золота до появления стального цвета. 10. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия. 11. Промывают в дистиллированной воде. 12. Переносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, затем проводят через ацетон, ксилол, заключают в бальзам. Результат: на сером фоне видны темные нервные клетки, ядра, нейрофибриллы в нервных клетках и синаптических волокнах, синаптические окончания
Третий метод Рамон-и-Кохаль Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1- 12 капель (для большого мозга 1- 3 капли, моз жечка- 4, спинного и продолговатого мозга- 8- 12, периферических окончаний - 2 - 3) раствора аммиака (молекулярная масса 0, 910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2- 4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.
Окраска глии методом Рамон-и. Кохаля 1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды). 2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место. 3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. 4. Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания. 5. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло. Результат: в белом веществе на сиреневом фоне (разной интенсивности) четко определяются черновато фиолетовые фиброзные астроциты, а в сером веществе - более светлые
Окраска глии методом Хорнеца 1. Срезы переносят в дистиллированную воду, на 100 мл которой добавлено 15 капель раствора аммиака (недолго). 2. Помещают в 5 % раствор бромисто водородной кислоты на 1 ч при температуре 37 °С. 3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды, а затем в дистиллированной воде, к которой добавлено несколько капель уксусной кислоты. 4. Переносят на 15- 24 ч в раствор, состоящий из 1 г трихлорида золота в 75 мл дистиллированной воды +25 мл 2 % сулемы+18 мл дистиллированной воды + 15 капель уксусной кислоты, препараты приобретают темно коричневую или красно коричневую окраску. 5. Помещают в 5 % раствор щавелевой кислоты (до приобретения ими серой окраски). 6. Ополаскивают в дистиллированной воде, переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия с несколькими каплями раствора аммиака; быстро ополаскивают и заключают. Результат: на сиреневом фоне выявляются темно синие фиброзные астроциты с отростками, видны капилляры и красные эритроциты в их просвете.
